人罗丹纳（ryr）ELISA试剂盒检测说明书

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人罗丹纳(ryr)ELISA试剂盒检测说明书

【信息说明】

中文名：人罗丹纳(ryr)ELISA试剂盒

别名：人罗丹纳(ryr)ELISA Kit

供应商：上海远慕

规格：48t/96t

保存：2~8℃

有效期：6个月

样本：血清、血浆、细胞上清液、尿液、体液、灌洗液、脑脊髓、心房水、胸房水、组织等。

特点：敏感性高、特异性强、重复性好、试剂稳定、易保存，操作简便。

用途：用于测定血清，血浆及相关液体样本中相关含量或活性。

种属：人、大鼠、小鼠、兔子、猪、犬、猴、马、牛、羊、鸡、鸭、鱼等。

检测原理：采用双抗体夹心ABC-ELISA法。

【样本处理】

1、血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2、血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3、尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4、细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5、组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS(PH7.4)，用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

6、标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.

7、不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。

【试剂配制】

1、酶联板(Assay plate )：一块(96孔)。

2、标准品(Standard)：2瓶(冻干品)。

3、样品稀释液(Sample Diluent)：1×20ml/瓶。

4、生物素标记抗体稀释液(Biotin-antibody Diluent)：1×10ml/瓶。

5、辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 (HRP-avidin Diluent)：1×10ml/瓶。

6、生物素标记抗体(Biotin-antibody)：1×120μl/瓶(1：100)

7、辣根过氧化物酶标记亲和素(HRP-avidin)：1×120μl/瓶(1：100)

8、底物溶液(TMB Substrate)：1×10ml/瓶。

9、浓洗涤液(Wash Buffer)：1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。

10、终止液(Stop Solution)：1×10ml/瓶(2N H2SO4)。

【操作步骤】

1、待测样品孔中每孔加入待测样品100μl，每种样品设3个平行孔;设两个阴性对照孔，每孔加未处理组的细胞裂解液100μl;另设一个空白对照孔，加入纯细胞裂解液100μl。 

2、酶标板置4℃，包被过夜。

3、洗板：吸干孔内反应液，用洗涤液过洗一遍(将洗涤液注满板孔后，即甩去)，之后将洗涤液注满板孔，浸泡1-2分钟，间歇摇动。甩去孔内液体后在吸水纸上拍干。重复洗涤3-4次。

4、阴性对照孔每孔加入PBS 50μl，样品孔及空白孔每孔加入1:500稀释的兔抗人AIF抗体工作液50μl。 

5、酶标板置37℃培养箱的湿盒内，孵育60min。 

6、洗板，同(4)。 

7、每孔加1:5000稀释的HRP-标记的山羊抗兔抗体工作液 100μl。 

8、酶标板置37℃培养箱的湿盒内，孵育60min。 

9、洗板，同(4)。 

10、每孔加TMB显色液 100μl，轻轻混匀10s，置37℃暗处反应15-20min。 

11、每孔加100μl 2mol/L H2SO4终止反应。 

12、分别测450nm 吸光值W1和630nm吸光值W2，zui终测得的OD值为两者之差(W1-W2)，以减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。

13、数据处理：在得出标本(S)和阴性对照(N)的 OD值后，计算S/N值。S/N≥2.1为阳性判定标准。

【注意事项】

1、实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。

2、试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。

3、使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。

4、不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。

5、洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。

6、使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。

7、加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。

8、按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。

9、底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。

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